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標(biāo)本采集的基本要求

點(diǎn)擊次數(shù):1365 更新時(shí)間:2016-01-08

    人和動(dòng)物細(xì)胞的標(biāo)本采集的選擇與處理是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件,是進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的*步,若選擇與處理不當(dāng),將會(huì)直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng),現(xiàn)將基本要求和注意事項(xiàng)敘述如下:

一、標(biāo)本采集的基本要求

(一)標(biāo)本的采集

1.新鮮標(biāo)本組織易于培養(yǎng)成功,取材時(shí)應(yīng)在4~6h內(nèi)盡快能制作成細(xì)胞,盡快培養(yǎng),若不能即時(shí)培養(yǎng),應(yīng)將標(biāo)本組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi),于4℃存放。若標(biāo)本組織塊較大,應(yīng)在清除表面血塊、壞死組織、脂肪和結(jié)締組織后,將其切成1cm3以下的小塊于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放,但時(shí)間不能超過24h。

2.若對所取標(biāo)本材料懷疑有污染,應(yīng)將所取標(biāo)本組織在含高濃度青、(400~800U/ml)甚至加入適量的的培養(yǎng)液于4℃下存放2h以上,再用PBS洗2~3次,以確保所取標(biāo)本材料無菌。

3.所取標(biāo)本材料應(yīng)避免紫外線的照射;避免接觸有毒有害的化學(xué)物質(zhì),如碘、汞等。

4.標(biāo)本取材應(yīng)注意組織類型、分化程度、年齡等,一般來講,胚胎組織較成熟個(gè)體組織容易培養(yǎng),分化低的較分化高的組織容易生長,腫瘤組織較正常組織容易培養(yǎng)。

5.原代細(xì)胞取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。對組織的來源、部位、包括供體的一般情況要做詳細(xì)的記錄,以備以后查詢。

(二)材料與器材

    需要取材的各類組織;平衡鹽溶液;手術(shù)刀、眼科剪、鑷子、止血鉗、;平皿、小燒杯、三角燒瓶、無菌的大頭針、75%酒精棉球;消毒過的木板、蛋架等。

二、各類組織標(biāo)本的取材技術(shù)

(一)皮膚和黏膜標(biāo)本的取材

1.皮膚和黏膜是上皮細(xì)胞培養(yǎng)的重要組織來源,主要取白于手術(shù)過程中的皮片,方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作,但面積一般2~3cm3即可,局部不留瘢痕,但取材時(shí)不要用碘酒消毒。

2.若培養(yǎng)上皮細(xì)胞,取材時(shí)不要切取太厚,盡可能去除所攜帶的皮下或黏膜下組織;若培養(yǎng)成纖維細(xì)胞,則反之。

3.皮膚黏膜因表面細(xì)菌、真菌很多,標(biāo)本取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格消毒,必要時(shí)要用高濃度抗菌素和適量漂洗、浸泡。

(二)內(nèi)臟和實(shí)體瘤標(biāo)本的取材

1.內(nèi)臟標(biāo)本除消化道外基本是無菌的;實(shí)體瘤標(biāo)本若沒有壞死或潰破基本也是無菌的。

2.內(nèi)臟和實(shí)體瘤標(biāo)本取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類型和部位。

3.實(shí)體瘤標(biāo)本取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域,要避開破潰、壞死液化部分,以防污染。

4.由于成纖維細(xì)胞的生長給以后的培養(yǎng)工作增加困難,因此要除去不需要的部分如血管、神經(jīng),尤其結(jié)締組織。

(三)血液細(xì)胞標(biāo)本的取材

1.一般多抽取靜脈外周血,或從淋巴組織中(如脾、扁桃體、胸腺、淋巴結(jié)等)分離細(xì)胞,操作嚴(yán)格無菌,盡量新鮮使用。

2.血液細(xì)胞標(biāo)本取材時(shí)應(yīng)注意抗凝,通常采用肝素抗凝,常用肝素濃度為8~10U/ml血,肝素濃度過大導(dǎo)致溶血。若從血站取來的獻(xiàn)血員的血液,因常用含枸櫞酸鹽抗凝,對此類血標(biāo)本不能用含鈣、鎂離子的洗液來處理細(xì)胞以免加速血液中促進(jìn)血液凝固而影響收獲血細(xì)胞及淋巴細(xì)胞。

(四)骨髓、羊水、胸/腹水細(xì)胞標(biāo)本的取材

    嚴(yán)格無菌操作,注意抗凝,盡快分離培養(yǎng)。離心后,用無鈣、鎂離子PBS洗兩次,再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng),不宜低溫存放。

(五)動(dòng)物組織取材

1.鼠胚組織取材

(1)引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物,將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中2~3s(時(shí)間不能太長,以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi),影響組織活力)。

(2)從含有75%酒精的燒杯中取出動(dòng)物,在消毒木板上可用無菌的圖釘或大頭針固定四肢,用無菌止血鉗挾起皮膚、用無菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開皮膚,用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾,把動(dòng)物反包,暴露軀干,然后再固定。

(3)更換無菌解剖器材,采用無菌操作法解剖取出胚胎,置于無菌平皿中。

2.幼鼠胚腎(或肺)取材幼鼠采用上述方法處死消毒后:

(1)腹部朝上固定在木板上,先切開游離毛皮并拉開至兩側(cè),然后采用無菌法打開胸腔取肺。

(2)或背部朝上固定在木板上,先將背部毛皮切開、游離并拉向兩側(cè),然后采用無菌法從背部打開腹腔取腎。

(六)雞(鴨)鳥類胚胎組織取材

1.取孵化至適當(dāng)胚齡(9~12d)的胚蛋,用照蛋燈在暗處燈檢,若有豐富血管、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋,說明胚體發(fā)育良好,并用有色筆畫出氣室和胚體位置。

2.將胚蛋置于蛋架上,先用溫水清洗蛋殼,用75%酒精棉球擦干,再經(jīng)碘酒、75%酒精消毒后,在無菌條件下采用無菌法用剪刀或中號鑷子打開氣室,沿氣室邊緣去除蛋殼,再用眼科鑷撕去殼膜,暴露出雞胚,再用彎頭鑷輕挑起胚頭,取出胚胎,放入無菌平皿中,解剖取材。

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