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蛋白的Wnt基因-6(WNT6)ELISA試劑盒原理

點(diǎn)擊次數(shù):1161 更新時(shí)間:2016-03-21


     此法采用定量夾心酶聯(lián)免疫技術(shù)??贵w具體為WNT6已經(jīng)被預(yù)先涂到微孔板。標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸入井和任何WNT6目前被綁定的固定化抗體。共軛的抗體特異性WNT6除去任何未結(jié)合的物質(zhì)后,加入到孔中??沟鞍坠曹椀睦备^氧化物酶(HRP)的洗滌后,加入到孔中。經(jīng)過洗滌,以除去任何未結(jié)合的抗蛋白的酶試劑,底物溶液加入到孔中,顯色成比例的量的初始步驟中的約束的WNT6。彩色顯影被停止并測量的顏色的強(qiáng)度。ELISA試劑盒

   血清:使用血清分離管(SST)和全血標(biāo)本在室溫下兩小時(shí)或4℃過夜℃,然后離心15分鐘,在1000×g下。刪除上清即可檢測,或分裝和店內(nèi)樣品在-20°C或-80°C。但應(yīng)避免反復(fù)凍融循環(huán)。

此法具有較高的靈敏度和特異性好,檢測鼠標(biāo)WNT6。觀察鼠標(biāo)WNT6和類似物之間無顯著交叉反應(yīng)或干擾。

精度: 

批內(nèi)精密度(內(nèi)檢測精度):CV%<8%

三種已知濃度的樣品進(jìn)行了測試20次在一個(gè)平板上進(jìn)行評估。

間精密度(精密檢測間):CV%<10%

已知的三個(gè)樣本20檢測到的濃度進(jìn)行了測試評估。

樣品采集和存儲(chǔ):

等離子:采集血漿中EDTA或肝素作為抗凝血?jiǎng)T?-8°C在30分鐘內(nèi)收集離心15分鐘,1000×G。即可檢測,或分裝保存樣本在-20°C或-80°C。但應(yīng)避免反復(fù)凍融循環(huán)。

檢測程序:

在使用前,將所有試劑和樣品室溫。再次離心樣品解凍后測定前。據(jù)建議,所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)來測定一式兩份。

1。準(zhǔn)備好所有試劑,工作標(biāo)準(zhǔn)和樣品在前面的章節(jié)中。

2。請確定井?dāng)?shù)的使用,并把任何剩余的井和入袋干燥劑,密封保鮮袋,將未使用的井在4°C的含量布局表

。每孔加入100μl的標(biāo)準(zhǔn)和樣品。封面用膠粘帶提供。孵育2小時(shí),在37℃下一盤布局記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品檢測。

4。每孔中取出的液體,不洗。

5。向每孔中加入100μl抗體(1倍)。蓋上一個(gè)新的膠粘帶。孵育1小時(shí),在37℃下(抗體(1X)可能會(huì)出現(xiàn)混濁。預(yù)熱至室溫,輕輕混勻,直到出現(xiàn)均勻解決方案。)

6。吸液的各孔和洗滌,共洗滌三次重復(fù)該過程兩次。洗凈,每孔填充洗滌緩沖液(200μL)使用噴瓶,多道移液器,歧管器,或autowasher,和,靜置2分鐘,*清除液體的每一步是*的良好的性能。zui后一次洗滌后,清除任何剩余洗滌緩沖液的吸ordecanting。倒置板和涂抹對干凈的紙巾。

7。向每孔中加入100μl的HRP-抗蛋白(1×)。量的微量滴定板,用一個(gè)新的粘接劑條。溫育1小時(shí),在37℃下

8。重復(fù)的愿望/洗滌過??程中,在步驟6的5倍。

9。將90μlTMB底物添加到每個(gè)孔中。孵育15-30分鐘,在37℃下避光

10。一站式解決方案,每孔加入底物,輕輕晃動(dòng)酶標(biāo)板,以確保充分混合。

11。在5分鐘內(nèi),設(shè)置至450nm,使用酶標(biāo)儀測定各孔的光密度。如果波長校正,設(shè)置為540nm或570nm處。在540nm或570nm波長在450nm處的讀數(shù)減去讀數(shù)。該減法校正板的光學(xué)缺陷。在450nm處未經(jīng)修正讀數(shù)直接,可能會(huì)比較高,不太準(zhǔn)確。

計(jì)算結(jié)果:

建議使用專業(yè)的軟“曲線專家1.3”的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
平均每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)和樣品的重復(fù)讀數(shù)和平均減去零標(biāo)準(zhǔn)的光學(xué)密度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過減少使用能產(chǎn)生四參數(shù)邏輯(4-PL)的曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件的數(shù)據(jù)。作為一種替代方法,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,對在y-軸的濃度通過繪制在x-軸為每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的平均吸光度,并繪制一個(gè)通過在曲線圖上的點(diǎn)的zui擬合曲線。該數(shù)據(jù)可以通過繪制的WNT6濃度與日志的OD值和擬合直線的日志,可以通過回歸分析確定線性化。此過程會(huì)產(chǎn)生足夠的,但不太的適合的數(shù)據(jù)。

如果已稀釋的樣品,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出的濃度必須乘以稀釋因子。ELISA試劑盒

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