17羥孕酮Elisa試劑盒是如何進行細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇
17羥孕酮Elisa試劑盒為了防止因污染或技術(shù)原因使培養(yǎng)功虧一簣，考慮到培養(yǎng)細(xì)胞因傳代而遲早會出現(xiàn)變異，有時因寄贈、交換和購買，培養(yǎng)細(xì)胞從一個實驗室轉(zhuǎn)運到另一個實驗室，的策略是進行低溫保存。這對于維持一些特殊細(xì)胞株的遺傳特性極為重要?，F(xiàn)簡要介紹深低溫保存法(－70℃~－196℃)的特點。細(xì)胞深低溫保存的基本原理是：在-70℃以下時，細(xì)胞內(nèi)的酶活性均己停止，即代謝處于*停止?fàn)顟B(tài)，故可以保存。細(xì)胞低溫保存的關(guān)鍵，在于通過0~20℃階段的處理過程。在此溫度范圍內(nèi)，水晶呈針狀，極易招致細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。
1. 細(xì)胞的凍存
為避免污染造成的損失，zui小化連續(xù)細(xì)胞系的遺傳改變和避免有限細(xì)胞系的老化和轉(zhuǎn)化，需要凍存哺乳細(xì)胞。凍存細(xì)胞前，細(xì)胞應(yīng)該特性化并檢查是否污染。
有幾種普通培養(yǎng)基用來凍存細(xì)胞。對于包含有血清的培養(yǎng)基，成分可能如下：
◆包含10%甘油的*培養(yǎng)基，
◆包含10%二甲基亞砜（DMSO）的*培養(yǎng)基，
◆50%細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%甘油的新鮮培養(yǎng)基，
◆50%細(xì)胞條件培養(yǎng)基和50%含有10%二甲基亞砜的新鮮培養(yǎng)基。
對于無血清培養(yǎng)基，一些普通的培養(yǎng)基成分可能是：
◆50%細(xì)胞條件無血清培養(yǎng)基和50%包含有7.5%二甲基亞砜的新鮮的無血清培養(yǎng)基，或
◆包含有7.5%二甲基亞砜和10%細(xì)胞培養(yǎng)級BSA的新鮮無血清培養(yǎng)基。
（1）懸浮細(xì)胞
●計數(shù)將要凍存的活細(xì)胞。細(xì)胞應(yīng)該處于對數(shù)生。以大約200～400 g離心5分鐘沉淀細(xì)胞，使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以1×107到5×107細(xì)胞/ml密度，在包含有血清的冷凍培養(yǎng)基中再次懸浮細(xì)胞，或者以0.5×107到1×107在無血清培養(yǎng)基中，再次懸浮細(xì)胞。
●分裝進凍存管，將凍存管置于濕冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
（2）貼壁細(xì)胞
●使用分離試劑從基層分離細(xì)胞，分離時盡可能溫和，使對細(xì)胞的損傷減少到zui小。
●在*生長培養(yǎng)基中，再次懸浮分離細(xì)胞，確定有活力細(xì)胞數(shù)。
●以大約200 g離心5分鐘沉淀細(xì)胞。使用移液管移去上清到zui小體積，不要攪亂細(xì)胞。
●以5×106到1×106細(xì)胞/ml密度，在凍存液中懸浮細(xì)胞。
●分裝進凍存管，將凍存管置于濕的冰上或放入4℃冰箱中，5分鐘內(nèi)開始冷凍步驟。
●細(xì)胞以1℃/分鐘進行冷凍，可以通過可編程序的冷凍器進行或者把隔離盒中的凍存管放到-70℃到-90℃的冰箱中，然后轉(zhuǎn)移到液氮中貯存。
2. 凍存細(xì)胞的復(fù)蘇
凍存細(xì)胞較脆弱，要輕柔操作。凍存細(xì)胞要快速融化，17羥孕酮Elisa試劑盒并直接加入*生長培養(yǎng)基中。若細(xì)胞對凍存劑（DMSO或甘油）敏感，離心去除凍存培養(yǎng)基，然后加入*生長培養(yǎng)基中。
（1）直接鋪板方法
●取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。
●直接用*生長培養(yǎng)基鋪板細(xì)胞。1 ml凍存細(xì)胞使用10~20 ml*生長培養(yǎng)基。進行活細(xì)胞計數(shù)，細(xì)胞接種應(yīng)該至少在3×105活細(xì)胞/ml。
●培養(yǎng)細(xì)胞12到24小時，更換新鮮的*生長培養(yǎng)基，去除凍存劑。
（2）離心方法
●取出貯存細(xì)胞，37℃水浴中快速融化。
●把1到2 ml凍存細(xì)胞加入到大約25 ml*生長培養(yǎng)基，輕輕混勻。
●以大約80x g離心2到3分鐘。
●棄去上清。
●在*生長培養(yǎng)基輕輕再次懸浮細(xì)胞，并且進行活細(xì)胞計數(shù)。
●17羥孕酮Elisa試劑盒細(xì)胞鋪板，細(xì)胞接種應(yīng)該至少為3×105活細(xì)胞/ml。
